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  • 蛋白质组学及修饰组学

    时间:2017-09-14
    一.行业背景
    人类基因组的解码开创了以基因解析为特征的个体化医学新时代。然而,基因型与疾病表型的不相关性揭示出个体化医学的本质在于疾病最相关的功能分子----蛋白质。蛋白质修饰(Protein Post-translational Modification, PTM)是蛋白质行使功能的最高级形态,是表观遗传现象的核心内容。因此,以蛋白质修饰-表观遗传为特征的生物医学研究是个体化医学领域的最前沿。
    表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰, 即探索从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴学科。表观遗传学信息提供了何时、何地、以何种方式去执行DNA遗传信息的指令, 它通过有丝分裂和减数分裂将遗传信息从上一代传递给下一代。表观遗传学的研究内容分为基因转录过程中的调控和基因转录后的调控两部分 。主要包括DNA甲基化, 组蛋白修饰, 非编码RNA等。
    组蛋白修饰是表观遗传学研究的重要方向之一。组蛋白有很多修饰形式, 包括乙?;?、甲基化、琥珀?;?,巴豆?;?,磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP核糖基化等等。由于组蛋白和DNA组成的核小体是染色质结构包装的基本单位,组蛋白修饰能够通过改变核小体构象最终影响整个染色体的结构和功能。组蛋白修饰在转录调节,DNA修复,DNA复制,可变剪切和染色质凝集过程中发挥重要作用,因此也与重大疾病和表型变化密切相关。
    蛋白质修饰与表观遗传学是生物医学最前沿的研究领域,是21世纪生命科学与生物技术产业化的战略前沿和主要突破口。国际人类蛋白质组组织宣布全面启动“国际人类蛋白质组计划(HPP)”到国内陆续出来各项政策文件明确宣示在国家政策层面上重点支持个体化医学和蛋白质组学研究与产业化转化。
    时间 到了2015年,奥巴马在国情咨文中宣布了一个预算为2.15 亿美元的精准医学计划(Precision Medicine);何为精准医疗?精准医疗是指以个人基因组信息为基础,结合蛋白质组、代谢组等相关内环境信息,为患者量身设计出最佳治疗方案,以期达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。紧随其后,中国宣布在2030年前,在精准医疗上将投入600亿元,其中中央财政支付200亿元,企业和地方财政配套400亿元。这意味着以蛋白质组和修饰组为核心的技术将迎来产业化的春天,学了这么多年的生物,做了这么多年实验,我们终于不用再抱怨今天学生物流的汗是当年填志愿脑子进的水,我们广大志在生命科学领域一展宏图的虫友们,需要努力打下扎实的专业基础,为属于我们行业的时代积蓄力量!
    二,专业知识
    前面扯得有些远,OK,进入正题。蛋白质的组学层面的研究,主要通过对病毒,微生物,植物,动物,以及人类的蛋白质在不同的环境和条件的影响下,表达水平和修饰水平的变化,来寻找关键的影响基因表达调控和细胞信号通路的蛋白,从而为生物性状改良,诊断标记物筛选和药物靶点的寻找提供科学基础。
    在常规蛋白质组学上,主要实验流程为样品制备——蛋白提取——酶解肽段——HPLC分组分——LC-MS质谱检测——生物信息学分析(GO注释,KEGG通路,蛋白结构域和蛋白互作等等)。
    在修饰蛋白质组学上,多了一个修饰抗体富集修饰肽段的过程,主要实验流程为样品制备——蛋白提取——酶解肽段——修饰抗体富集(乙?;?,甲基化,琥珀?;鹊龋狧PLC分组分——LC-MS质谱检测——生物信息学分析(GO注释,KEGG通路,蛋白结构域和蛋白互作等等)。
    而在定量蛋白质组学中,常用的标记技术为iTRAQ/TMT技术(样品为组织),和SILAC(样品为可稳定穿代的细胞),下面针对这2中标记技术原理和标准分别阐述:
    1,iTRAQ/TMT定量蛋白质组学技术
    (1)技术简介
    研究不同生理病理条件下组织内蛋白质的表达水平的变化是比较蛋白质组学的核心内容。要揭示上述动态过程往往需要进行多个样本的同步比较分析。近年来,在体内和体外稳定同位素标记基础上,用多维相色谱分离多肽,进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一。
    iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由美国AB Seiex公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用多达8种稳定同位素标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,然后进行串联质谱分析,可同时比较多达8种不同样品中蛋白质的相对含量。
    (2)技术优点
    l iTRAQ标记技术可在一次实验同时对多达8个样本进行定量分析,降低了反复实验引入的技术误差,8个样品之间可进行任意两两比较,增加实验设计的灵活性??捎糜诙喔鍪奔涞愕鞍字首槎浠募嗖?;灵活增加实验重复/技术重复以及进行多个个体样本的研究。
    l 该技术为体外标记,可标记各种动物组织、植物组织、微生物、体液、细胞等样本。
    l 重复性好,灵敏度高,蛋白覆盖范围广,在单张谱图中同时进行定性与定量。
    l 标记完全,标记效率高达97%以上,等质量的同位素标签不增加样品的复杂程度。
    l 一次实验可定量3000-5000种蛋白(2个unique peptides以上)。
    (3)技术原理
    l iTRAQ试剂由三部分组成:1)报告基团(reporter group)相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121 Da; 2)平衡基团(balance group)相对分子质量分别为192、191、190、189、187、186和184 Da; 3)反应基团(peptide reactive group)形成8种分子量为305 Da的等质量同位素标签。
    l iTRAQ试剂标记酶解后的肽段,可与氨基酸N端及侧链的一级胺发生反应。在一级谱图中,来自于不用样品的同一肽段,标记后,表现为相同的质荷比。
    l 在二级质谱中,报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂,带不同同位素标签的同一肽段产生质量为113、114、115、116、117、118、119和121Da的报告离子,根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。
    (4)送样标准
    l 动物组织的样品量湿重不少于200 mg。
    l 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2 g。
    l 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5 g;如植物的根,木质部、韧皮部组织等。
    l 体液类(唾液、羊水、脑脊液等)10 mL以上,要保证不能溶血;血清要求500 μl以上;尿液要求50 mL以上。
    l 如直接提供蛋白质提取物,浓度不少于2 mg/mL,总量不少于1 mg。为保证实验效果,请尽量告知缓冲液成分,如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。
    l 在细胞器蛋白质组学方面,提取细胞器或亚细胞器后,蛋白沉淀量在1 mg以上。
    三 , 修饰蛋白质组学应用
    目前针对不同物种的普通蛋白质组学谱图数据,已经不再具有新颖性。必须要针对得到的组学数据得到的关键蛋白进行深入挖掘,进行功能验证,才能成为一篇漂亮的工作。而蛋白质翻译后修饰是和蛋白质功能息息相关,如组蛋白乙?;腿ヒ阴;苯庸叵档阶技せ钣氤聊?,细胞中各种激酶直接受到磷酸化调节其活性。而从组学层面研究这些修饰目前还看还是非常新颖的方向。无论针对一个物种的修饰谱图解析,还是针对某一种修饰(乙?;?,琥珀?;龋┰诓煌淼纳镅分械牟钜?,从而解析出和蛋白功能相关的修饰,为分子诊断和药物靶点以及农林性状改良提供新型的技术基础。下面针对不同的case一一解析:
    1,蛋白质修饰定性组学
    针对某一个物种(如水稻,拟南芥,小鼠,斑马鱼等)里的新型修饰做修饰组学谱图,可作为一个领域的开创性的工作。定性不需要标记样品。
    (1)技术路线

    适用于乙?;?、磷酸化、甲基化、巴豆?;?、琥珀?;?、丙?;?、丁?;?、丙二?;?、泛素化等一系列修饰类型的蛋白质修饰全谱分析,可以检测出全蛋白中发生特定修饰的几乎所有蛋白及对应蛋白上的修饰位点。

    (2) 应用
    运用高质量泛乙?;固迮剂氖髦透吡槊舳纫合嘀势琢梅治?,以及高级生物信息学分析,我们在大肠杆菌中鉴定了349个乙?;奘蔚鞍坠?070个乙?;奘挝坏?,报道了迄今为止单一原核细胞中最大的乙?;?。

    2,蛋白质修饰定量组学
    针对动物组织,植物组织和细胞系,进行不同处理后,使用iTRAQ和SILAC标记技术,研究其在不同处理条件下,修饰水平的差异变化。

    3, 生物标志物,药物靶点和修饰酶底物的寻找
    寻找生物标志物(Biomarker):通过对正常组织和疾病组织的修饰组学,找到在疾病中广泛存在变化的修饰底物,即潜在的生物标志物或药物靶点,为临床诊断提供依据。
    寻找药物靶点:通过对用药和未用药的疾病细胞系或者模式生物,找到在用药后显著发生变化的修饰底物,可作为药物靶点,为新药筛选和设计提供参考;

     4.寻找修饰酶底物:在药物筛选和病原微生物互作中,在我们关注到修饰酶起重要调控作用后,我们想一步延伸寻找其对下游其他修饰底物(特别是涉及到关键通路和代谢上的修饰)是否还会发生影响。我们需要将酶活性进行抑制或者直接KO该酶基因,然后通过修饰组学看下有底物的变化。

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